Lasiutuminen ei syntynyt yhdestä keksinnöstä. Se kehittyi, kun tutkijat ratkaisivat peräkkäisiä ongelmia solujen, alkioiden ja elinten säilytyksessä sekä lopulta ihmisen biostaasissa.
Tavoite kuulostaa yksinkertaiselta: jäähdyttää vesipitoinen kudos lasimaiseen tilaan muodostamatta vahingollista jäätä.
Käytännön toteutus on kuitenkin vaikeaa. Kryoprotektantit voivat olla myrkyllisiä. Kryoprotektanttien vieminen soluihin voi vahingoittaa niitä. Suuret näytteet jäähtyvät epätasaisesti, niihin syntyy jännityksiä, ja niiden lämmittäminen takaisin on huomattavasti vaikeampaa.
Nykyaikaiset menetelmät ovat siksi kokonaisia järjestelmiä eivätkä yksittäisiä reseptejä. Niiden onnistuminen riippuu siitä, että kemia, perfuusio, lämpötila, ajoitus, geometria ja mittaus toimivat yhdessä.
Ennen lasiutumista: kylmä aiheutti toisen vaurion
Varhainen kryosäilytys tarkoitti käytännössä jäädyttämistä. Jäähdytys hidasti kemiallisia reaktioita, mutta vesi kristalloitui jääksi.
Jään muodostuessa suolat ja muut liuenneet aineet väkevöityvät jäljelle jäävään nesteeseen. Soluihin voi tällöin kohdistua samanaikaisesti mekaanisia rasituksia, erittäin suuria liuospitoisuuksia, kuivumista ja kalvovaurioita.
Nopeampi jäähdytys voi pienentää kristalleja, mutta tavallinen vesi vaatii poikkeuksellisen suuria jäähdytysnopeuksia muuttuakseen lasiksi ilman kemiallista apua. Se onnistuu vain äärimmäisen ohuissa näytteissä.
Alkuvaiheen ongelmana ei ollut pelkästään riittävän alhaisen lämpötilan saavuttaminen. Ongelmana oli saavuttaa tämä lämpötila ilman, että vesi muodostaa vahingollisia jääkiteitä.
1937 ja 1938: ensimmäiset kineettisen lasiutumisen kokeet
Basile Luyet esitti lasiutumisen biologisena säilytysmenetelmänä vuonna 1937.
Vuonna 1938 Luyet ja Eugene Hodapp raportoivat sammakon siittiöiden liikkuvuuden palautumisesta nestemäiselle ilmalle altistamisen jälkeen, kun ne oli ensin kuivattu väkevällä sakkaroosiliuoksella.
Alkuperäinen koe perustui mikroskooppisiin kalvoihin ja äärimmäiseen jäähdytysnopeuteen. Se osoitti fysikaalisen mahdollisuuden, ei skaalautuvaa elinsäilytysmenetelmää.
Tätä lähestymistapaa kutsutaan nykyisin kineettiseksi lasiutumiseksi: lämpöä poistetaan nopeammin kuin jää pystyy ytimöitymään ja kasvamaan.
Näytteen koon kasvu tekee menetelmästä kuitenkin epäkäytännöllisen. Tilavuus kasvaa kokoa kasvatettaessa pinta-alaa nopeammin, joten suuren näytteen keskiosa ei jäähdy yhtä nopeasti kuin sen pinta.
1949: glyseroli muuttaa ongelman luonnetta
Christopher Polge, Audrey Smith ja Alan Parkes havaitsivat vuonna 1949, että glyseroli voi suojata siittiöitä matalan lämpötilan säilytyksessä.
Heidän Nature-julkaisunsa osoitti soluihin tunkeutuvien kryoprotektanttien käytännön merkityksen.
Nämä molekyylit kulkeutuvat soluihin, sitovat vettä ja vähentävät tietyssä lämpötilassa muodostuvan jään määrää. Ne vähentävät myös haitallista liuospitoisuutta jäädytyksen aikana.
Löydös mullisti kryobiologian, koska jäähdytysnopeus ei ollut enää ainoa säädettävä tekijä. Liuoksen kemiallisella koostumuksella voitiin vaikuttaa veden faasikäyttäytymiseen.
Samalla syntyi uusi optimointiongelma. Suurempi kryoprotektanttipitoisuus estää jäätä tehokkaammin, mutta lisää kemiallista ja osmoottista vauriota.
1959 ja 1968: lisää aineita ja vaiheittainen lataus
Vuonna 1959 James Lovelock ja Marcus Bishop osoittivat, että dimetyylisulfoksidi suojasi useita solutyyppejä jäätymisvaurioilta.
DMSO kulkeutui joidenkin solukalvojen läpi glyserolia helpommin. Se laajensi kryosuojattavien solujen kirjoa ja on edelleen laajassa käytössä laboratorio- ja kliinisessä kryosäilytyksessä.
John Farrant tutki myöhemmin kryoprotektanttipitoisuuden asteittaista nostamista lämpötilaa laskettaessa siten, että kudos säilyi väkevässä liuoksessa ilman tarkoituksellista jäädyttämistä.
Tässä näkyi nykyisten menetelmien keskeinen periaate: kryoprotektantti lisätään vaiheittain matalassa lämpötilassa sen sijaan, että lämmin kudos altistettaisiin heti täydelle pitoisuudelle.
Vaiheittainen lataus rajoittaa osmoottista shokkia. Matalampi lämpötila hidastaa monia kemiallisia reaktioita ja voi parantaa kudoksen sietokykyä altistuksen aikana.
Vuonna 1968 kokeet osoittivat, että punasolut voivat saavuttaa nestemäisen typen lämpötilan näkyvää jäätä muodostamatta, kun glyserolipitoisuus on riittävän korkea.
Menetelmän keskeiset periaatteet olivat jo tiedossa. Puuttui käytännöllinen tapa soveltaa niitä monimutkaiseen, verisuonitettuun kudokseen.
1984: lasiutuminen muuttuu elinstrategiaksi
Vuoden 1984 artikkeli ”Vitrification as an Approach to Cryopreservation” esitti lasiutumisen vakavasti otettavana keinona elinpankkitoimintaan.
Strategiaa kutsuttiin toisinaan tasapainolasiutumiseksi. Mahdottoman suuren jäähdytysnopeuden sijaan kryoprotektanttia käytetään riittävästi, jotta kriittinen jäähdytysnopeus voidaan saavuttaa myös suuremmassa järjestelmässä.
Tämä muutos paljasti kolme toisiinsa kytkeytyvää rajoitetta:
- Liuoksen on pysyttävä jäätymättömänä käytännössä saavutettavilla jäähdytys- ja lämmitysnopeuksilla.
- Elimen on kestettävä liuoksen lataaminen ja poistaminen.
- Kryoprotektantin on jakauduttava elimen kaikkiin osiin ennen jäähdytyksen aloittamista.
Liuos saattoi toimia erinomaisesti koeputkessa mutta epäonnistua elimessä, koska verisuoniston virtausvastus, diffuusiomatkat tai myrkyllisyys vaikuttivat lopputulokseen.
1985: elävät alkiot palaavat lasimaisesta tilasta
William Rall ja Gregory Fahy raportoivat hiiren alkioiden jäätymättömän kryosäilytyksen lämpötilassa -196 °C vuonna 1985.
Tämä oli ratkaiseva biologinen osoitus. Elävät nisäkässolut, joissa on tuma, kestivät jäähdytyksen ja uudelleenlämmityksen, vaikka ne olivat kokonaan lasiutuneessa tilassa.
Alkiot ovat kuitenkin erittäin pieniä. Niiden lämpötila ja pitoisuus voivat muuttua nopeasti ja tasaisesti verrattuna aikuisen elimeen.
Tulos vahvisti menetelmän toimivuuden, mutta korosti samalla skaalautumiseen liittyviä ongelmia.
Skaalautumisongelma jakautuu neljäksi ongelmaksi
1. Kryoprotektanttien myrkyllisyys
Lasiutumiseen tarvittava pitoisuus voi häiritä proteiineja, kalvoja ja solun aineenvaihduntaa. Myrkyllisyys riippuu aineesta, pitoisuudesta, lämpötilasta, altistusajasta ja kudostyypistä.
Tämä tarkoittaa, ettei ”vähemmän myrkyllinen” ole yksittäisen molekyylin pysyvä ominaisuus. Se on koko lataus- ja poistoprotokollan ominaisuus.
2. Osmoottinen rasitus
Väkevän liuoksen lisääminen vetää vettä ulos soluista. Liuoksen poistaminen voi puolestaan saada veden palaamaan soluihin liian nopeasti.
Nykyaikaiset menetelmät käyttävät pitoisuuden porrastettua nostoa, kantajaliuoksia, lämpötilan säätöä ja soluun tunkeutumattomia liuenneita aineita pitääkseen tilavuuden vaihtelut sietokyvyn rajoissa.
3. Epätasainen jakautuminen
Elin ei ole tasaisen nesteen säiliö. Kryoprotektantti kulkeutuu verisuonten läpi, läpäisee hiussuonten seinämät ja diffundoituu kudokseen.
Verihyytymät, turvotus, verisuonisairaudet, iskemia ja veri-aivoeste voivat jättää osan alueista jäätä estävän pitoisuuden alapuolelle.
Siksi nykyaikaisessa perfuusiossa seurataan painetta, virtausta, lämpötilaa ja laskimoveren pitoisuutta pelkän käytetyn liuosmäärän sijaan.
4. Lämpötilagradientit
Suuri kappale jäähtyy ulkoa sisäänpäin. Eri lämpötilat aiheuttavat erilaisia supistumisnopeuksia.
Lasittumislämpötilan (Tg) lähellä ja sen alapuolella materiaali ei pysty purkamaan jännityksiä nopeasti. Jos jännitys ylittää materiaalin mekaanisen lujuuden, siihen voi syntyä murtumia.
Ratkaisuksi kehitettiin hallittu jäähdytysnopeus, hehkutus Tg:n lähellä ja hidas jäähdytys lasittumislämpötila-alueen läpi. Näitä periaatteita hyödynnetään nykyään tietokoneohjatussa ihmisen jäähdytyksessä.
1990-luku ja 2000-luku: seokset korvaavat yhden aineen ajattelun
Mikään yksittäinen kryoprotektantti ei täyttänyt kaikkia vaatimuksia parhaalla mahdollisella tavalla. Tutkijat alkoivat yhdistää useita soluun tunkeutuvia aineita, jotta kunkin aineen pitoisuus voitiin pitää sen haitallista tasoa pienempänä.
Kantajaliuokset säätelivät ioneja, pH:ta ja osmoottisia olosuhteita. Soluun tunkeutumattomat polymeerit vaikuttivat kudoksen veteen ja verisuonten toimintaan.
Synteettisillä jäänestäjillä pyrittiin estämään jään heterogeenista ydintymistä ja kiteiden kasvua. Ne vähensivät riippuvuutta yksin voimakkaan kryoprotektanttipitoisuuden käytöstä.
VS55:n ja myöhemmin M22:n kaltaiset liuokset edustivat järjestelmätason suunnittelua: niissä yhdistettiin useita aineita, jäänestäjiä, huolellisesti suunniteltu kantajaliuos sekä määritellyt perfuusio- ja lämpöprotokollat.
Vuoden 2004 katsaus elinten lasiutumiseen kuvaa edistystä myrkyllisyyden vähentämisessä, kylmävaurioissa, jään ytimöitymisen hallinnassa ja elinperfuusiossa.
Merkittävä edistysaskel ei ollut se, että myrkyllisyys katosi. Tutkijat oppivat vähentämään kokonaisrasitusta säätämällä kemiaa, altistusaikaa ja lämpötilaa yhdessä.
Kaniininmunuaiskokeet: tärkeitä mutta helppo tulkita liian vahvasti
Kaniininmunuaisilla tehdyt kokeet osoittivat, että verisuonitettu nisäkäselin voitiin käsitellä monimutkaisella lasiutumisliuoksella, jäähdyttää lasimaiseen tilaan, lämmittää uudelleen ja siirtää vastaanottajaan.
Yhden raportoidun munuaisen varassa kaniini säilyi pitkään, kun se oli eläimen ainoa toimiva munuainen.
Tulos on merkittävä, koska se siirtyi mikroskooppisista näytteistä elimen toimintaan. Se ei osoittanut luotettavaa kliinistä menetelmää.
Myöhempi tutkimuskirjallisuus toteaa, että pitkäaikaista siirteen onnistumista ei saatu toistettavasti aikaan. Jakautuminen, myrkyllisyys ja tavanomainen pintalämmitys jäivät rajoittaviksi tekijöiksi.
Tulosta on tulkittava näin: kyse oli merkittävästä periaatteellisesta osoituksesta, mutta menetelmää rajoittivat toistettavuus- ja skaalautumisongelmat.
2015: säilytyksen laatu tulee näkyväksi synapsitasolla
Aldehydistabiloitu kryosäilytys yhdisti kemiallisen fiksaation, kryoprotektanttiperfuusion ja lasiutumisen kaniinin ja porsaan aivoissa.
Vuoden 2015 tutkimuksessa havaittiin uudelleenlämmityksen ja elektronimikroskopista valmistelua seuranneessa tarkastelussa selvästi säilyneitä kalvoja, synapseja, vesikkeleitä, myeliiniä ja solunsisäisiä rakenteita.
Se osoitti, että hermokudoksen mikrorakenne saattoi säilyä hyvin jäätymättömän säilytyksen aikana myös suurissa aivoissa.
Se ei osoittanut elinkelpoista toipumista. Aldehydifiksaatio ristisitoo biologista materiaalia tarkoituksellisesti, ja se ei sovi yhteen tavanomaisen elävän toiminnan palauttamisen kanssa.
Koe antoi tietoa rakenteiden säilymisestä, ei siitä, voitaisiinko kudoksen toiminta palauttaa täysin.
Kokeen laajempi merkitys oli menetelmällinen: säilytyksen laatua on arvioitava tutkimalla juuri niitä rakenteita, joiden halutaan säilyvän, eikä pelkästään toteamalla näytteen näyttävän lasimaiselta.
2023: nanolämmitys ratkaisee rottien munuaisten uudelleenlämmityksen
Jäähdytys on vain puolet palautuvasta kryosäilytyksestä. Uudelleenlämmitys on usein vaikeampaa.
Jos lämmitys on liian hidasta, jäätä voi kasvaa devitrifikaation aikana. Jos lämpö saapuu pääosin pinnasta, lämpötilagradientit voivat murtaa elimen.
Nanolämmityksessä rautaoksidinanohiukkasia viedään verisuonistoon ja lämmitetään vaihtuvalla radiotaajuisella magneettikentällä, mikä voi ratkaista molemmat ongelmat.
Vuonna 2023 tutkijat lasiuttivat rottien munuaisia, säilyttivät niitä enintään 100 päivää, lämmittivät ne nanolämmityksellä ja siirsivät ne vastaanottajiin.
Toimintansa palauttaneet munuaiset ylläpitivät vastaanottajissa elintärkeää munuaistoimintaa raportoidun seuranta-ajan, vaikka vastaanottajilla ei ollut omia munuaisia.
Saavutus ei riippunut vain lämmityksestä. Tutkimusryhmä siirtyi vähemmän myrkylliseen formulaatioon ja mallinsi kryoprotektantin latausta kudospitoisuuden parantamiseksi.
Lasiutumisen historiassa toistuu sama havainto: yhden rajoittavan tekijän ratkaiseminen paljastaa seuraavan, ja onnistunut toipuminen edellyttää koko prosessin toimivuutta.
2024 ja 2026: suuremmat fyysiset järjestelmät ja toimiva hermokudos
Vuonna 2024 tutkijat raportoivat onnistuneesta fyysisestä lasiutumisesta ihmisen elimen kokoluokkaa vastaavissa 0,5 ja 3 litran järjestelmissä.
He yhdistivät sisäisen lämpömittauksen, hehkutuksen, säädellyn jäähdytyksen ja mikro-CT-tarkastelun. He osoittivat myös, että nanolämmitys toimii enintään 2 litran tilavuuksissa.
Suurimmat esittelyt olivat ensisijaisesti fyysisiä. Näkyvän jään ja halkeamien välttäminen on välttämätöntä, mutta se ei osoita ihmisen kokoisen elimen biologista toipumista.
Vuonna 2026 PNAS-tutkimus raportoi aikuisen hiiren hippokampuskudoksen lyhytaikaisen toiminnallisen toipumisen lasiutumisen ja uudelleenlämmityksen jälkeen.
Tutkimuksessa mitattiin morfologiaa, mitokondrioiden vasteherkkyyttä, hermosolujen ärtyvyyttä, synaptista välittymistä ja pitkäaikaista vahvistumista.
Kyse oli hiiren aivoleikkeistä ja kokonaisista aivovalmisteista, joiden onnistumisprosentti oli alhainen, ei ihmisen aivoista. Sen merkitys on suppeampi, mutta silti huomattava.
Se osoitti, että aikuisen nisäkkään hermokudos voi palauttaa sähköfysiologisia toimintoja lasimaisessa tilassa tapahtuneen molekyyliliikkeen pysähtymisen jälkeen.
Ihmisen biostaasissa samat ongelmat ovat vaikeampia
Elinpankkikokeet alkavat terveestä kudoksesta, hallitusta ajoituksesta ja suunnitellusta pääsystä verisuonistoon.
Ihmisen biostaasi alkaa laillisen kuoleman jälkeen. Sairaus, lämmin iskemia, verihyytymät, turvotus, kuljetus ja verisuonisairaudet voivat kaikki heikentää kryoprotektantin kulkeutumista.
Välittömänä tavoitteena on säilyttää rakenteet mahdollista tulevaa korjaamista varten, ei palauttaa toimintaa nykyisillä elinsiirtomenetelmillä.
Siksi laboratoriotuloksista ei voida tehdä suoria päätelmiä potilaista.
Miten Tomorrow.bio sovitti lasiutumisen kenttäolosuhteisiin
Tomorrow.bio toi koko kehon kryoprotektiivisen perfuusion erikoisambulansseihin. Toimenpide voidaan aloittaa potilaan luona sen sijaan, että odotettaisiin kuljetusta Sveitsiin.
Tämä muuttaa tärkeän tekijän, jota kemia ei voi korjata: iskemian keston ennen perfuusiota.
Nykyisessä protokollassa käytetään VM-1-pohjaista liuosta, joka on sovitettu kenttäolosuhteissa tehtävään kryosuojaukseen ja sitä seuraavaan kuivajääkuljetukseen.
EBF:n tutkimusohjelma on testannut VM-1:tä simuloiduissa kuolemanjälkeisissä olosuhteissa, myös tilanteissa, joissa lämmin iskemia on kestänyt kolme tuntia.
Tutkimusohjelmassa mitattiin laskimoveren taitekerrointa, perfuusioaikaa, painonmuutosta, aivojen kutistumista ja jäänmuodostusta, kun perfuusioliuokseen ja menetelmään tehtiin muutoksia.
Tässä on ihmispotilaiden biostaasin keskeinen käytännön kysymys: ei se, voiko ihanteellinen liuos lasiutua, vaan se, kuinka hyvin iskemian vaurioittama potilas voidaan perfusoida.
Mittaus tuli osaksi itse toimenpidettä
Varhainen lasiutumistutkimus osoitti onnistumisen usein läpinäkyvyyden, kalorimetrian, röntgendiffraktion, eloonjäämisen tai uudelleenlämmityksen jälkeisen toiminnan avulla.
Ihmisen biostaasissa toipumista ei voida käyttää nykyisenä tutkimuksen päätepisteenä. Sen sijaan tarvitaan säilymisen laatua arvioivia menetelmiä, jotka eivät tuhoa näytettä ja joissa käytetään näytteenottoa.
Tomorrow.bio kuvaa jokaisen potilaan CT:llä samassa nestemäisen typen lämpötilassa, jotta kryoprotektantin jakautumista voidaan arvioida ja jää sekä makroskooppiset viat havaita vakioiduissa olosuhteissa.
Erillisellä suostumuksella hermoston mikronäytteet voivat tukea elektronimikroskopiaan perustuvaa arviota kalvoista, synapseista ja paikallisesta mikrorakenteesta.
Näitä menetelmiä ja niiden rajoituksia käsitellään artikkelissa ”Biostaasin laadunvarmistusmenetelmät”.
Mittaukset ohjaavat myös menetelmien kehittämistä. Kun vika voidaan havaita ja sitä voidaan verrata eri tapausten välillä, liuosta ja protokollaa voidaan kehittää juuri tämän ongelman ratkaisemiseksi.
Mikä on parantunut ja mitä ei ole ratkaistu
Nykyaikainen lasiutuminen on saavuttanut useita asioita, joita varhainen jäädytys ei kyennyt saavuttamaan:
- Monien solujen, alkioiden ja pienten kudosten jäätymätön säilytys.
- Lasiutuneiden eläinelinten toiminnan palautuminen tarkasti rajatuissa kokeissa.
- Synapsitason rakenteellinen säilytys fiksatuissa nisäkkään aivoissa.
- Tietokoneohjattu suurempien järjestelmien jäähdytys ja hehkutus.
- Tilavuudellinen uudelleenlämmitys esimerkiksi nanolämmityksen avulla.
- CT- ja elektronimikroskopiamenetelmät todellisten säilytystulosten mittaamiseen.
Menetelmä ei ole mahdollistanut ihmisen koko kehon palautuvaa kryosäilytystä.
Jäljellä olevat ongelmat ovat kuoleman jälkeinen iskemia, epätasainen perfuusio, kryoprotektanttien myrkyllisyys, veri-aivoesteen vaikutukset, koko kehon lämpötilagradientit, murtumien välttäminen ja turvallinen tasainen uudelleenlämmitys.
Vaikka rakenteellinen säilytys onnistuisi, tulevaisuudessa olisi silti ratkaistava vaurioiden korjaaminen, elvytys ja kuolemaan johtaneen alkuperäisen sairauden hoito.
Näitä eroja käsitellään artikkelissa ”Palautuvan kryosäilytyksen tekniset haasteet”.
Yhteenveto: Lasiutuminen kehittyi kryoprotektanttikemian, perfuusion, jäänmuodostuksen hallinnan, jäähdytyksen, uudelleenlämmityksen ja rakenteellisen mittauksen edistysaskelten myötä. Osa ongelmista on ratkaistu pienessä mittakaavassa, mutta koko ihmiskehon toiminnan palauttaminen on edelleen ratkaisematta.
Tutustu tähän käytännön työkaluun
Käytä interaktiivista työkalua tarkastelemaan tämän artikkelin kysymystä.
Ladataan interaktiivista työkalua...
Lisää aiheesta