Laskeentuminen ei ollut yksi keksintö. Se syntyi, kun tutkijat ratkaisivat eri ongelmia soluissa, alkioissa, elimissä ja lopulta ihmisen biostaasissa.
Tavoite kuulostaa yksinkertaiselta: jäähdytä vettä sisältävä kudos lasiksi muodostamatta haitallisia jääkiteitä.
Toteutus ei ole yksinkertaista. Kryoprotektantit voivat olla myrkyllisiä. Niiden lataaminen voi vääristää soluja. Suuret kohteet jäähtyvät epätasaisesti, kertyvät jännitteitä ja ovat paljon vaikeampia lämmittää uudelleen.
Nykyaikaiset menetelmät ovat siksi järjestelmiä, eivät reseptejä. Niiden laatu riippuu siitä, että kemia, perfuusio, lämpötila, ajoitus, geometria ja mittaus toimivat yhdessä.
Ennen laskeentumista: kylmyys aiheutti toisen vamman
Varhainen kryopreservaatio tarkoitti pääasiassa jäädyttämistä. Jäähdyttäminen hidasti kemiaa, mutta vesi kiteytyi jääksi.
Jää sulkee suolat ja muut liuenneet aineet jäljelle jäävään nesteeseen. Solut voivat siksi kokea mekaanista siirtymää, äärimmäisiä liuenneiden aineiden pitoisuuksia, kuivumista ja kalvovauriota samanaikaisesti.
Nopeampi jäähdytys voi tehdä kiteistä pienempiä, mutta tavallinen vesi vaatii poikkeuksellisen nopeita jäähdytysnopeuksia muuttuakseen lasiksi ilman kemiallista apua. Se toimii vain erittäin ohuille näytteille.
Historiallinen ongelma ei ollut pelkästään matalan lämpötilan saavuttaminen. Se oli sen saavuttaminen siten, ettei vesi päässyt järjestäytymään haitallisiin kiteisiin.
1937 → 1938: ensimmäiset kineettiset lasittumiskokeet
Basile Luyet esitti lasittumisen biologisen säilöntästrategiana vuonna 1937.
Vuonna 1938 Luyet ja Eugene Hodapp raportoivat sammakon siittiöiden liikkeen palautumisesta nestemäiseen ilmaan altistamisen jälkeen, kun ne oli kuivattu väkevällä sokerilla.
alkukokeenalkukokeenriippui mikroskooppisista kalvoista ja äärimmäisen nopeasta jäähdytyksestä. Se osoitti fyysisen mahdollisuuden, ei skaalautuvaa elimen protokollaa.
Tätä lähestymistapaa kutsutaan nykyään kinetiseksi vitrifioinniksi: estä kiteytyminen poistamalla lämpöä nopeammin kuin jää voi muodostua ja kasvaa.
Skaalaaminen voittaa sen. Pinta-ala kasvaa hitaammin kuin tilavuus, joten suuren näytteen keskusta ei voi seurata pintaa riittävän nopeasti.
1949: glyseroli muuttaa ongelmaa
Christopher Polge, Audrey Smith ja Alan Parkes havaitsivat vuonna 1949, että glyseroli voi suojata siittiöitä alhaisen lämpötilan säilytyksen aikana.
Hei,Nature-raportti osoitti käytännön tärkeyden läpäisevien kryosuojausaineiden käytössä.
Nämä molekyylit tunkeutuvat soluihin, sitovat vettä ja vähentävät muodostuvan jään määrää tietyssä lämpötilassa. Ne myös vähentävät haitallista liuotinpitoisuutta jäätymisen aikana.
Löytö mullisti kryobiologian, koska jäähdytysnopeus ei enää ollut ainoa kontrolloitava muuttuja. Kemiallinen koostumus saattoi muuttaa veden faasikäyttäytymistä.
Se toi myös uuden optimointiongelman. Enemmän kryoprotektanttia estää jään muodostumisen tehokkaammin, mutta lisää kemiallista ja osmoottista vauriota.
1959 1968: enemmän aineita ja askelittainen lataus
Vuonna 1959 James Lovelock ja Marcus Bishop raportoivat dimetyylisulfoksidin suojaavan useita solutyyppejä jäätymisvaurioilta.
DMSO läpäisi joitakin kalvoja helpommin kuin glyseroli. Se laajensi solujen määrää, joita voidaan kryosuojata, ja sitä käytetään edelleen laboratorioissa ja kliinisessä kryopreservaatiossa.
John Farrant tutki sitten kryoprotektanttipitoisuuden nostamista samalla kun lämpötilaa laskettiin, pitäen kudoksen konsentroidussa nesteessä ilman, että jäätä muodostuisi tahallisesti.
Tämä ennakoi modernin protokollan ydinasiaa: lataa kryoprotektantti askelittain matalassa lämpötilassa sen sijaan, että altistaisit lämpimän kudoksen täydelle pitoisuudelle kerralla.
Askelittainen lataus rajoittaa osmoottista shokkia. Matalampi lämpötila hidastaa monia kemiallisia reaktioita ja voi tehdä muuten haitallisesta altistuksesta siedettävämpää.
Vuonna 1968 kokeet osoittivat punasolujen voivan saavuttaa nestemäisen typen lämpötilan ilman näkyvää jäätä riittävän korkealla glyserolipitoisuudella.
Käsitteelliset osat olivat olemassa. Puuttui vielä käytännöllinen tapa soveltaa niitä monimutkaiseen, verisuonittuneeseen kudokseen.
1984: vitrifikaatiosta elimen strategia
Vuoden 1984 artikkeli“Vitrification as an Approach to Cryopreservation” uudelleenmuotoili vitrifikaation vakavasti otettavaksi vaihtoehdoksi elinten säilytykselle.
Strategiaa kutsuttiin joskus tasapainotetuksi vitrifikaatioksi. Sen sijaan, että vaatisi mahdottomalta tuntuvaa jäähdytysnopeutta, käytä tarpeeksi kryoprotektanttia, jotta kriittinen jäähdytysnopeus olisi saavutettavissa suuremmassa järjestelmässä.
Tämä muutos paljasti kolme toisiinsa kytkeytyvää rajoitusta:
- Ratkaisun on kestettävä jäätä saavutettavissa olevilla jäähdytys- ja lämpenemisnopeuksilla.
- Elimen on kestettävä liuoksen lataamista ja purkamista.
- Kryoprotektantti on päästävä jokaiseen alueeseen ennen kuin jäähdytys alkaa.
Yhdiste voi toimia hienosti koeputkessa ja epäonnistua elimessä, koska verisuonivastus, diffuusiomatka tai myrkyllisyys muuttivat tulosta.
1985: elävät alkioit palaavat lasimaisesta tilasta
William Rall ja Gregory Fahy raportoivatjäättömästä kryosäilytyksestä hiiren alkioille klo -196°C paikassa 1985.
Tämä oli ratkaiseva biologinen osoitus. Elävät tumalliset nisäkässolut selvisivät jäähdytyksestä ja lämpenemisestä täysin lasittuneen tilan läpi.
Alkiot ovat vielä pieniä. Niiden lämpötila ja pitoisuus voivat muuttua nopeasti ja tasaisesti verrattuna aikuisen elimeen.
Tulos vahvisti menetelmän, mutta mittakaavan ongelma tuli entistä näkyvämmäksi.
Mittakaavan ongelma jakautuu neljään ongelmaan
1. Kryoprotektanttien myrkyllisyys
Vitrifiointiin tarvittava pitoisuus voi häiritä proteiineja, kalvoja ja solujen aineenvaihduntaa. Myrkyllisyys riippuu aineesta, pitoisuudesta, lämpötilasta, altistusajasta ja kudostyypistä.
Tämä tarkoittaa, että 'vähemmän myrkyllinen' ei ole yhden molekyylin yksinomainen ominaisuus. Se on täydellisen lataus- ja purkuprotokollan ominaisuus.
2. Osmoottinen stressi
Keskittyneen liuoksen lisääminen vetää vettä soluista pois. Sen poistaminen voi puolestaan saada veden palaamaan liian nopeasti takaisin.
Nykyaikaiset protokollat käyttävät pitoisuusrampeja, kantaliuoksia, lämpötilan hallintaa ja läpäisemättömiä liuottimia pitääkseen tilavuuspoikkeamat siedettävissä rajoissa.
3. Epätasainen jakautuminen
Elin ei ole tasalaatuisen nesteen säiliö. Kryoprotektantti kulkee verisuonten kautta, läpäisee hiussuonten seinämiä ja diffusoituu kudoksen läpi.
Veritulpat, ödeema, verisuonitaudit, iskemia ja veri-aivoeste voivat jättää joitakin alueita alle pitoisuuden, joka tarvitaan jään muodostumisen estämiseen.
Tästä syystä modernitperfuusio -mittaukset mittaavat painetta, virtausta, lämpötilaa ja laskimopitoisuutta ratkaisun tilavuuden sijaan.
4. Lämpötilagradientit
Suuri kappale jäähtyy ulkopuolelta sisäänpäin. Eri lämpötilat aiheuttavat erilaisia supistumisnopeuksia.
Lasisiirtymäalueen lähellä ja sen alapuolella materiaali ei pysty vapauttamaan jännitystä nopeasti. Jos jännitys ylittää sen mekaanisen lujuuden, murtumia voi muodostua.
Ratkaisu oli kontrolloitu jäähdytys, hehkutus lähellä Tg:tä ja hitaampi laskeutuminen lasimaisen alueen läpi. Nämä periaatteet muokkaavat nykyääntietokoneohjattua ihmisen jäähdytystä.
Vuosikymmen, joka alkoi vuonna 1990, ja vuosikymmen, joka alkoi vuonna 2000: sekoitukset korvasivat yksittäisen aineen ajattelun
Yksikään kylmäsuoja-aine ei täyttänyt kaikkia vaatimuksia. Tutkijat yhdistivät yhä enemmän läpäiseviä aineita, jotta kukin voisi vaikuttaa ilman saavuttamatta pahinta yksittäistä pitoisuuttaan.
Kantajaliuokset kontrolloivat ioneja, pH:ta ja osmoottisia olosuhteita. Läpäisemättömät polymeerit vaikuttivat kudoksen veteen ja verisuoniston käyttäytymiseen.
Synteettiset jääesteet kohdistuivat heterogeeniseen jään nukleaatioon ja kasvuun. Ne vähensivät riippuvuutta pelkästään kylmäsuoja-aineiden pitoisuudesta.
Ratkaisut kuten VS55 ja myöhemmin M22 edustivat systeemistä suunnittelua: useita aineita, jääesteitä ja huolellisesti suunniteltua kantajakemia yhdistettynä määriteltyihin perfuusio- ja lämpötilaprotokolliin.
Artikkelissa2004 katsaus elinten vitrifiointiin kuvataan myrkyllisyyden vähentämisen, kylmävaurion, nukleaation hallinnan ja elinten perfuusion edistysaskeleita.
Tärkeä edistysaskel ei ollut se, että myrkyllisyys katosi. Tutkijat oppivat jakamaan taakan kemian, ajan ja lämpötilan kesken.
Kaniininmunuaiskokeet: tärkeitä ja helppo liioitella
Kaninmunuaistyö osoitti, että verisuonittunut nisäkkään elin voidaan ladata monimutkaisella vitrifiointiliuoksella, jäähdyttää lasimaiseen tilaan, lämmittää uudelleen ja siirtää.
Yhdessä raportoidussa tapauksessa munuainen toimi ainoana toimivana munuaisena kanille pitkän ajan.
Tämä tulos on tärkeä, koska se siirtyi mikroskooppisten näytteiden tasolta elimen toimintaan. Se ei kuitenkaan osoittanut luotettavaa kliinistä menetelmää.
Myöhemmässä kirjallisuudessa huomautetaan, että pitkäaikainen siirron onnistuminen ei ollut toistettavasti saavutettu. Jakelu, toksisuus ja perinteinen pinnan lämmitys olivat rajoittavia tekijöitä.
Tämä on oikea tieto-opillinen asema: merkittävä periaatteen todiste, mutta toistettavuuden ja mittakaavan ongelma.
2015: säilöntälaatu näkyy synaptisella tasolla
Aldehydistabiloitu kryopreservaatio yhdisti kemiallisen kiinnityksen, kryoprotektanttien perfuusion ja vitrifioinnin kaniinin ja sian aivoissa.
Tutkimus2015 raportoi selkeät kalvot, synapsit, rakkulat, myeliinit ja solunsisäiset rakenteet lämmityksen ja valmistelun jälkeen elektronimikroskopiaa varten.
Se osoitti, että erinomainen hermostollinen solurakenne voi säilyä jäätymättömässä varastointisyklissä suurissa aivoissa.
Se ei osoittanut elinkelpoista palautumista. Aldehyydin kiinnitys sitouttaa tahallaan biologisen materiaalin ja on ristiriidassa normaalin elävän toiminnan palauttamisen kanssa.
Koe vastasi siis rakenteelliseen kysymykseen, ei täydellisen herättämisen kysymykseen.
Sen laajempi merkitys oli metodologinen: säilöntä tulisi arvioida tarkastelemalla kiinnostavia rakenteita, ei pelkästään havainnoimalla, että näyte näyttää lasimaiselta.
2023: nanolämmitys ratkaisee uudelleenlämmityksen rotan munuaisissa
Jäähdytys on vain puolet käännetystä kryosäilönnästä. Uudelleenlämmitys on usein vaikeampaa.
Jos lämmitys on liian hidasta, jäätä voi muodostua lasittumisen aikana. Jos lämpö saapuu pääasiassa pinnalta, lämpötilaero voi halkaista elimen.
Nanolämmitys ratkaisee molemmat ongelmat jakamalla rautaoksidinanohiukkasia verisuoniston läpi ja lämmittämällä niitä vuorottelevalla radiotaajuisella magneettikentällä.
Julkaisussa 2023 tutkijatlasittivat rotan munuaiset, säilöivät niitä jopa 100 päivän ajan, lämmittivät ne nanolämmityksellä ja siirsivät ne.
Munuaiset palauttivat elämälle välttämätöntä munuaistoimintaa vastaanottajilla, joilta omat munuaiset puuttuivat raportoidun seurannan aikana.
Saavutus ei perustunut pelkästään lämpenemiseen. Ryhmä vaihtoi vähemmän myrkylliseen formulaatioon ja mallinsi kryoprotektanttien latausta kudoksen pitoisuuden parantamiseksi.
Tämä on toistuva oppitunti vitrifikaation historiassa: yhden pullonkaulan ratkaiseminen paljastaa seuraavan, ja onnistunut palauttaminen vaatii koko ketjun toimivan.
2024 2026: suurempia fyysisiä järjestelmiä ja toiminnallista hermostokudosta
Vuonna 2024 tutkijat raportoivatfyysisestä lasittumisesta ihmiselimen mittakaavassa 0.5:n ja 3 litran järjestelmissä.
He yhdistivät sisäisen lämpötilan mittauksen, hehkutuksen, kontrolloidun jäähdytyksen ja mikro-CT-tarkastuksen. He myös osoittivat nanolämmityksen jopa 2 litran tilavuuksissa.
Suurimmat osoitukset olivat pääasiassa fyysisiä. Näkyvän jään ja halkeamien välttäminen on välttämätöntä, mutta se ei osoita biologista palautumista ihmisen kokoisen elimen osalta.
Vuonna 2026 julkaistiinPNAS-tutkimus, jossa raportoitiin lyhytaikaisesta toiminnallisesta palautumisesta aikuisen hiiren hippokampuskudoksesta vitrifioinnin ja lämpenemisen jälkeen.
Tutkimuksessa mitattiin morfologiaa, mitokondrioiden reaktiivisuutta, hermosolujen sähköistä aktiivisuutta, synaptista transmissiota ja pitkäaikaista potentiaatiota.
Siinä käytettiin hiiren aivoleikkeitä ja vähäsaantisia kokonaisia aivoja, ei ihmisaivoja. Sen merkitys on suppeampi mutta silti huomattava.
Se osoitti, että aikuisen nisäkkään hermostokudos voi palauttaa sähköfysiologisia toimintoja sen jälkeen, kun molekyylien liikkuvuus on pysähtynyt lasitilaan.
Ihmisen biostaasi hyödyntää tiedettä vaikeammissa olosuhteissa
Elinten säilytyskokeet alkavat terveestä kudoksesta, kontrolloidusta ajoituksesta ja suunnitellusta pääsystä verisuonistoon.
Ihmisen biostaasi alkaa laillisen kuoleman jälkeen. Sairaus, lämpöiskemia, hyytyminen, ödeema, kuljetus ja verisuonitauti voivat kaikki haitata kryoprotektanttien toimittamista.
Välitön tavoite on rakenteellinen säilytys mahdollista tulevaa korjausta varten, ei nykyajan käännettävissä olevaa siirtoa.
Tämä ero on syy siihen, miksi laboratorioiden väitteitä ei voida kopioida suoraan potilaisiin liittyviksi väitteiksi.
Miten Tomorrow.bio sovelsi vitrifikaatiota kenttäolosuhteisiin
Tomorrow.bio siirsi koko kehon kryoprotektiivisen perfuusion erikoistuneisiin ambulansseihin. Toimenpide voidaan aloittaa potilaan lähellä sen sijaan, että odottaisi kuljetusta Sveitsiin.
Tämä muuttaa tärkeän tekijän, jota kemia ei voi korjata: iskemian määrän ennen perfuusiota.
Nykyinen protokolla käyttää VM-1-pohjaista liuoksen kemiaa, joka on sovellettu kenttäkylmäkuivaukseen ja sitä seuraavaan kuivajään kuljetukseen.
Sinä oletEBF:n tutkimusohjelma on testannut VM-1:ta simuloiduissa kuolemanjälkeisissä olosuhteissa, mukaan lukien kolme tuntia lämmintä iskemiaa.
Ohjelma mittasi laskimon taitekerrointa, perfuusion aikaa, painon muutosta, aivojen kutistumista ja jään muodostumista testatessaan perfuusionesteen ja proseduurin muutoksia.
Tämä on käytännön eturintama ihmistapauksissa: ei se, voidaanko ihanteellinen ratkaisu lasittua, vaan kuinka hyvin todellinen iskeeminen potilas voidaan perfusoida.
Mittaus tuli osaksi menettelyä
Varhaiset vitrifiointitutkimukset määrittivät onnistumisen usein läpinäkyvyyden, kalorimetrian, röntgendiffraktion, uudelleenlämpenemisen jälkeisen selviytymisen tai toiminnan avulla.
Ihmisten biostaasi ei voi käyttää nykyhetken päätepistettä toipumista. Siksi se tarvitsee ei-tuhoutuvia ja näytteenotettuja mittareita säilöntälaadun arvioimiseksi.
Tomorrow.bio tekee joka potilaalle CT-kuvauksen samassa nestetypen lämpötilassa arvioidakseen kryoprotektanttien jakautumista ja tunnistaakseen jäätä tai makroskooppisia vikoja standardisoiduissa olosuhteissa.
Erillisellä suostumuksella hermosolujen mikro-näytteet voivat tukea elektronimikroskopian arviointia kalvoista, synapseista ja paikallisesta ultrastruktuurista.
Näitä menetelmiä ja niiden rajoituksia kuvataanbiostasiin laadunvalvontamenettelyissä.
Mittaus muuttaa kehitystä itseään. Kun vika tulee näkyväksi ja vertailukelpoiseksi tapauksien välillä, kemiaa ja protokollaa voidaan muuttaa sen kohdistamiseksi.
Mikä on parantunut, ja mikä ei ole vielä ratkaistu
Nykyaikainen lasittaminen on saavuttanut useita asioita, joita varhainen jäädyttäminen ei pystynyt:
- Jäätymättömän säilönnän monille soluille, alkioille ja pienille kudoksille.
- Vitrifioitujen eläinten elinten toiminnallinen palautuminen määritellyissä kokeissa.
- Synaptisen mittakaavan rakenteellinen säilyminen kiinnitetyissä nisäkäsaivoissa.
- Tietokoneohjattu jäähdytys ja hehkutus suuremmille järjestelmille.
- Tilavuudellinen uudelleenlämmitys teknologioilla kuten nanolämmitys.
- TT- ja elektronimikroskopiamenetelmät todellisten säilymistulosten mittaamiseen.
Se ei ole tuottanut käännettävää ihmisen koko kehon kryopreservaatiota.
Ongelmat, jotka ovat jäljellä, sisältävät kuolemanjälkeisen iskemiaa, epätasaista perfuusiota, kryoprotektanttien toksisuutta, veri-aivoesteen vaikutuksia, koko kehon lämpötilaeroja, murtumien välttämistä ja turvallista tasaista uudelleenlämmitystä.
Jopa onnistunut rakenteellinen säilyminen jäisi tulevaisuuden ongelmiksi korjaamisessa, herättämisessä ja alkuperäisen kuolinsyyn hoidossa.
Nämä erot kehitetään kohdassatekniset haasteet käännettävälle kryopreservaatiolle.
TL;DR: Lasittaminen parani parempien kryoprotektanttien, perfuusion, jään hallinnan, jäähdytyksen, uudelleenlämmityksen ja rakenteellisen mittauksen kautta. Jotkin ongelmat on ratkaistu pienissä mittakaavoissa, kun taas koko ihmisen käännettävyys on edelleen ratkaisematta.
Tutustu tähän käytännön työkaluun
Käytä interaktiivista työkalua tarkastelemaan tämän artikkelin kysymystä.
Ladataan interaktiivista työkalua...
Lisälukemista